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      8-OHdG檢測樣品預處理程序(組織/細胞培養)-JaICA
      2020-07-08 2308 分享到:

      Detection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in tissue/cultured cells.

      JaICA高靈敏度8-OHdG Check ELISA試劑盒適用樣品包括組織,細胞培養,血清/血漿,尿液,本文介紹8-OHdG檢測前的組織/細胞培養樣品預處理程序(點擊這里查看8-OHdG檢測血清/血漿樣品預處理程序)。

      這是檢測組織樣品或培養細胞中的8-OHdG的應用示例。實驗條件應由每個用戶確定。

      1. 從細胞中提取DNA

      使用DNA提取試劑盒從勻漿中提取DNA。請遵照產品說明書操作。


      以下是適用于8-OHdG檢測的DNA提取試劑盒,可從WAKO Chemicals USA Inc.和WAKO Chemicals GmbH(德國)獲得。

      1)DNA提取? WB試劑盒(碘化鈉的方法):目錄號291-50502

      2)DNA提取? TIS試劑盒(碘化鈉的方法):目錄號296-67701

      3)的8-OHdG檢測制劑試劑組:目錄號292- 67801

      2. DNA濃度和純度的計算

         a) 用TE緩沖液將DNA溶液稀釋至20-50 μg / mL。

         b) 在230nm,260nm,280nm和320nm波長處測量吸光度。

         C) 計算DNA濃度。(260nm處的吸光度1.0等于50 μg / mL DNA)

      DNA濃度(μg / mL)=(260nm處的吸光度)*(50 μg / mL)*稀釋率

         d) 檢查DNA樣品的純度。

      (260nm處的吸光度):(280nm處的吸光度)之比通常在1.8至1.85之間。

      分離的DNA的純度通過(在260nm處的吸光度)與(在230nm處的吸光度)之比評估,并且應在2.2至2.25之間。

      3. DNA的酶消化

         a) 將200 μg提取的DNA溶解在135 μL的水中。

         b) 向DNA溶液中加入15微升200mM乙酸鈉和6單位核酸酶P1(15 μL,1 mg / mL),然后在氬氣置換后于37°C孵育30分鐘至1小時。

         C) 加入1M Tris-HCl緩沖液(15 μL,pH 7.4)和2單位堿性磷酸酶(7 μL,200單位/0.7mL),在氬氣置換后于37°C孵育30分鐘至1小時。

         d) 為了除去酶和其他大分子,將水解產物通過Millipore Microcon YM-10(catalog#42407)在14000rpm下過濾10分鐘。

         e) 將50 μL DNA消化液加到ELISA試劑盒的孔中。建議應在一天之內完成此處提到的分析程序。

       注意:

      1)經酶處理的樣品應在同一天使用。

      2)TE緩沖液:1mM EDTA / 10mM Tris-HCl,pH8.0

      3)所用的水應通過Chelex(Bio Rad)處理以去除痕量金屬離子。


      參考文獻

      1) ML Hamilton,Z Guo,CD Fuller,H Van Remmen,WF Ward,SN Austad,DA Troyer,I Thompson,A Richardson:

      使用碘化鈉方法可靠地評估核和線粒體DNA中的8-oxo-2-deoxyguanosine水平分離DNA。

      核酸研究。Vol.29(10),p2117-2126,2001

      2) S豐國等。等:

      單克隆抗體N45.1定量免疫組織化學測定8-羥基-2'-脫氧鳥苷:在次氮基三乙酸鐵誘導的腎癌模型中的應用。

      實驗室調查,第一卷。76,No.3,p365-374,1997年

      3) M Kakimoto,T Inoguchi,T Sonta,HY Yu,M Imamura,T Etoh,T Hashimoto和H Nawata:

      糖尿病大鼠腎臟中8-羥基-2'-脫氧鳥苷的積累和線粒體DNA缺失。

      糖尿病卷 51,p1588-1595,2002

      4) D Nakae,Y Mizumoto,E Kobayashi,O Noguchi和Y Konishi:

      改進的基因組/核DNA提取技術可用于少量大鼠肝組織的8-羥基脫氧鳥苷分析。

      癌癥通訊。97,p233-239,1995


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